Иммуноферментный анализ. Гомогенный анализ

К числу достоинств р-галактозидазы E.coli относится способность ряда соединений модулировать ее активность. Способность к модулированию активности фермента и его высокая каталитическая активность являются основой при создании гомогенного ИФА. Определение гормонов стероидной и полипептидной природы, кардиогликозидов и других важных гаптенов в гомогенном анализе с использованием р-галактозидазы E.coli описано.

Иммуноферментный анализ. Гомогенный анализ

Обращает на себя внимание тот факт, что конъюгаты р-галактозидазы с лигандами сохраняют значительную ферментативную активность и характеризуются высокой степенью ингибирования при связывании с антилигандными рецепторами. Показано, что скорость гидролиза ферментом конъюгата гентамицина с умбеллиферил — р — Д-галактопи-ранозидом обратимо ингибируется антителами к гентамицину и возрастает пропорционально концентрации антибиотика в анализируемой смеси. Аналогичный принцип положен в основу определения. К преимуществам метода относятся отсутствие эндогенного фермента в образцах, прочность гликозидной связи, что исключает спонтанный гидролиз субстрата и линейность калибровочных кривых в широком интервале концентраций антигена. Так называемый субстрат меченый гомогенный ИФА на основе р-галактозидазы Е. coli по чувствительности, точности и надежности не уступает РИА и легко поддаётся автоматизации.

Гомогенный анализ, основанный на стерической доступности высокомолекулярного декстрана, сшитого с о-нитро-фенил — р — Д-галактопиранозидом, к активному центру р-галактозидазы, описан. Показано, что связывание IgG, меченых р-галактозидазой, с вторичными антителами ингибирует ферментативную активность на 95%. Присутствие в образце свободного lgG, в зависимости от его концентрации, приводит к возрастанию ферментативной активности. Чувствительность определения lgG в сыворотке этим способом составила 25 нг/мл.

Данные по высокочувствительному гомогенному анализу поливалентных антигенов, основанному на амплификации сигнала, в реакции, катализируемой р-галактозидазой (в микроокружении с отрицательным зарядом), представлены в публикаци. Необходимыми компонентами системы анализа являются антитела, меченые р-галактозидазой, сукцинилированные антитела для создания отрицательного микроокружения и макромолекулярный субстрат. Конъюгат р-галактозидазы с антителами связывается с поливалентным антигеном, к которому добавляют сукцинилированные антитела.

Этот комплекс с локальным отрицательным зарядом вокруг фермента расщепляет макромолекулярный субстрат с образованием второй жидкой фазы, рассеивающей свет. Показано, что образование этой фазы обусловлено макромолекулярный субстратом. Таким образом, увеличение концентрации антигена в анализируемой смеси вызывает рост отрицательного заряда вокруг фермента за счет большого связывания сукцинилированных антител, находящихся в избытке, и генерирует в светорассеивающей фазе с высоким усилением детектируемый сигнал. Продукты этой фазы находятся в состоянии суспендированных капель, концентрация которых определяется турбидиметрически. Данный метод позволил определить до 10 нг/мл IgG.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *